非洲豬瘟熒光定量PCR儀標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

　　一、實驗前準(zhǔn)備

　　1.設(shè)備預(yù)熱：

　　開啟非洲豬瘟熒光定量pcr儀，選擇預(yù)運行程序進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)熱，建議預(yù)熱時間≥30分鐘。檢查各溫控模塊性能，確保溫度波動≤±0.5℃（95℃測試點）。

　　2.樣本處理：

　　核酸提?。翰捎蒙唐坊怂崽崛≡噭┖校凑f明書操作獲取DNA模板。提取后的核酸需在2小時內(nèi)完成檢測，-20℃保存不得超過7日。

　　試劑準(zhǔn)備：配制反應(yīng)體系（20μL體系）：

　　（1）2×熒光PCR反應(yīng)液 10μL

　?。?）引物探針混合液 1μL

　?。?）酶混合物 0.5μL

　　（4）模板DNA 5μL（濃度50-100ng/μL）

　?。?）滅菌ddH?O 3.5μL

　　配置好的反應(yīng)體系于冰上保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。

　　二、實驗操作規(guī)程

　　1.上機設(shè)置

　　選擇ASFV專用檢測程序：

　?。?）預(yù)變性：95℃ 30s

　?。?）循環(huán)擴增（40 cycles）：

　　①變性：95℃ 5s

　?、谕嘶?延伸：60℃ 30s

　　③熒光采集：FAM通道（探針檢測）

　　2.樣本裝載

　　將配置好的反應(yīng)管裝入加熱模塊，確認(rèn)：

　　（1）管蓋密封完好

　?。?）試管無氣泡殘留

　　（3）樣本編號與軟件對應(yīng)

　　設(shè)置陰性對照（N/C）、陽性對照（P/C）和標(biāo)準(zhǔn)品，建議每板設(shè)置3個N/C。

　　3.儀器運行：啟動PCR程序，實時監(jiān)控擴增曲線。正常狀態(tài)下，陰性對照應(yīng)無S型擴增，陽性對照CT值應(yīng)在18-25之間。

　　三、結(jié)果分析與報告

　　1.數(shù)據(jù)分析

　　CT值判定標(biāo)準(zhǔn)：

　?。?）CT≤30且呈現(xiàn)典型S型曲線為陽性

　　（2）CT＞35或無擴增曲線為陰性

　?。?）30＜CT≤35需重復(fù)驗證

　　FAM通道Ct值≤閾值（可參照試劑盒要求）判定為ASFV核酸陽性。

　　2.報告生成

　　報告內(nèi)容應(yīng)包含：

　?。?）樣本編號及來源；

　?。?）CT值及擴增曲線圖；

　　（3）陽性/陰性判定結(jié)果；

　?。?）檢測及復(fù)核人員簽名；

　?。?）檢測日期及實驗室信息；

　　3.廢棄處理：實驗結(jié)束后，生物危害廢棄物需按規(guī)程處理，反應(yīng)管置于專用廢料桶中。
 

　　四、非洲豬瘟熒光定量pcr儀注意事項

　　1.操作全程必須穿戴防護(hù)服和手套；

　　2.每批次實驗需同時設(shè)立陰、陽性對照；

　　3.儀器表面每日使用75%乙醇消毒；

　　4.建議每月使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；

　　5.當(dāng)檢測結(jié)果異常時，必須進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)。

　　本操作流程嚴(yán)格遵循GB/T 40947-2021《非洲豬瘟診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范化的操作可有效預(yù)防交叉污染，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實驗室需建立完整的質(zhì)量控制體系，定期對操作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，為非洲豬瘟防控工作提供科學(xué)依據(jù)。